１．基礎技術としての超薄切片法
（５）トリミングと薄切
平板に包埋した試料をトリミング、薄切するには（図10）に書かれているように、平板から一度試料を切り出し、方向を考えた上で円筒形の台に接着しなければならない。接着には瞬間接着剤を用いる。また、円筒形の台は包埋の際に余った樹脂をカプセルに流し込み作製しておく。最初から円筒形のビームカプセルに包埋した方がはやいように見えるが、急がば回れで、試料組織の方向を決めて切片を作ることを考えるとこちらの方が便利である。
実体顕微鏡で見ながら、ヤスリ、カミソリ刃を使用してトリミングをするので、ワーキングディスタンスの長い実体顕微鏡を購入すると良い。（図12）のようなトリ ミング専用のコーナーを造り、道具を並べておくと便利である。薄切を容易にするには（図10）のように試料の一部を上面が0.5
mm×0.5 mm程度のきれいなピラミッドに削り出す。特に削りだしたピラミッド上面と側面の角度は120度ぐらいで、丸みを帯びずにシャープな方が薄切には適している（図11参照）。
図10 トリミング過程の図
（注）試料表面との角度（白色の両端矢印）は120度くらいで丸みを帯びないこと。
|
|
図11 トリミングによりピラミッド状に削りだした試料の側面拡大図
（注）右図のように上部表面と側面との角が丸くなると薄切しにくいので、左図のようにシャープにする。
|
|
図12 トリミング用実験台と道具の例
|
|
トリミング後、試料ブロックをウルトラミクロトームに装着する。（図13）はLEICA社製ミクロトームに試料を装着した写真である。超薄切片をいきなり切るのではなく、まずトリミングした面を平らにし、1ミクロン厚程度の切片（準超薄切片：semi-thin
section）を切り、光学顕微鏡で観察し、目的とする組織細胞が表面に露出されているか確認する。そののち超薄切片を作製する。表面出しや試料組織の確認のためのsemi-thin
section の作製には通常ガラスナイフを使用する。一般にガラスナイフではボートとよばれる水受けを装着し、そこに水を張り、切片を水面上に展開して回収する。しかし、荒削りや確認用の準超薄切片の作製には必ずしもこのボートをつける必要はない。荒削りの時点で重要なことは左右の角度、仰角をともにゼロとして始めることである（便宜的に我々はゼローゼロと呼んでいる）。試料面が平らになったら、後述のように1
前後の切片を作り試料の向きなどを確認する。必要に応じ左右の角度を変え目的とする方向の切削面を露出させる。これまでの経験では、ここに紹介しているように、平板包埋し切り出して方向性を考えて台に接着した場合には、ほとんど角度を変える必要はなかった。特に仰角を変えることはなかった。ナイフを交換するとき、あるいは後日切片作製を続ける時には再度面合わせをしなければならないが、この時角度がほぼゼローゼロであると大変便利である。
|
図13 トリミング後のブロックをウルトラミクロトームに装着した図
（注）ガラスナイフで荒削りし、さらに準超薄切片をつくり、光学顕微鏡で試料の方向性を確認する。 |
面合わせ
ナイフを交換した時、後日同一面から再び切片を作製しようとする時、試料面とナイフ面を再度一致させる「面合わせ」という作業が必要である。また、厚みのない培養細胞から水平方向の切片を得ようとする場合は最初から正確な面合わせが必要である。面合わせは初心者にとって多少難しいところであるが、避けて通れないので練習により習得する必要がある。
プロトコール
- 試料ブロックをミクロトームに装着し、ダイヤモンドナイフを取り付ける。目分量で試料面と刃先の間を2 mmぐらいまで近づける。手動でゆっくりと試料ブロックを上下させ、改めて試料とナイフとの位置関係を確認する。この時ナイフが正しいclearance angleをもって装着されていることも確認する。
- ミクロトームのビノキュラーを覗きながら、左手でナイフ粗動送りノブを少しずつ回転させ、ナイフを試料ブロック手前0.1 mm位まで近づける。この時右手は試料ブロックを上下させる回転ハンドルにおき、必要に応じてハンドルを回し、ブロックを上下させ、試料面とナイフの位置を確認する。（試料面を１ヶ所に停止させたままだと距離感が掴めないので）
- ナイフと試料面との間が0.1 mm位まで近づくと試料面に黒いナイフの影を明瞭に認めることができるようになる（ただし斜め手前からの蛍光灯の照明がある時のみ）。最近のウルトラミクロトームでは試料面の真下からも照明できるようになっており、この時は逆に刃先で反射した光によりナイフと試料面間隔に対応した明るい帯を試料面上に映し出す（図14）。この刃先の影、あるいは明るい帯の形と幅を指標にして刃先と試料面の相互位置関係を決める。
- 試料面と刃先が平行であればこの影または明るい帯は長方形となる。もし左右どちらかが広い場合は広いほうにナイフを振り、長方形とする。また、試料ブロックを上下させた時、この刃先の影または明るい帯の幅が同一であれば試料面の全面に渡って刃先との間隔が一定であることを示している。すなわち仰角が合っていることを示している。もし、影または明るい帯の幅が変化するようであれば、仰角を動かし、一定になるように調節する。試料ブロックを下に動かした時幅が広がるようであれば仰角ノブを回転し、試料ブロックを前に倒れる方向（上方）に少し移動させる。逆の時は下方に移動させる。
- 以上の調節をし、試料の上下運動に対し刃先の影あるいは明るい帯の形が長方形でその幅が一定になれば試料面とナイフの間隔が一定であり、面合わせが終了したことになる。試料ブロックを上下させながら微動でナイフを前進させ切片作製を開始する。
|
図14 刃先と試料面の間が一定の時の図
（注）刃先と試料が全面に渡って一定な間隔（平行）だとこのように刃先の影は長方形になり、試料を上下させてもその幅は変化しない（右図）
|
|
図15 刃先と試料面の間が左右で異なる時の図
（注）左図は刃先の左が右より試料面から離れているところを表している。一方右図はその逆で刃先の左が試料面に近づき、右が試料面から離れているところを表している。それぞれ矢印の方向にナイフを回転させ、補正する。
|
|
ガラスナイフの作り方
ガラスナイフは市販のナイフ用ガラス板をナイフメーカーで割断し作製される。（図16）に示すLKB型のナイフメーカーでは専用の25 mm×400
mm（6 mm厚）の細長いガラス板を用いる。このガラスの両長辺はすでに極めて平らな鏡面仕上げになっており、簡単にしかも一度に二つのナイフが出来るのが特徴である。 一方、（図17）に示すような旧三慶（株）のナイフメーカーでは10 cm×10 cm（6 mm厚）のガラス板を用いてナイフを作る。この機械ではまずナイフの刃となるべき、鏡面仕上げの割面を自分で作る必要があり、2回ほど多く割断の手間がかかる。しかし、40年ほど前までガラスカッターとプライヤーを用いてナイフを作製していたことに比べれば、極めて質の良いナイフが容易に出来る。現在ではこの型のナイフメーカーを使用している研究者は少なくなっていると思われる。我々はLKB型のナイフメーカーを所有しているものの、旧三慶のナイフメーカーで使用するガラスの方が経済的なので使用している。その作製の手順を（図18）に示した。最近ではガラスカッターとプライヤーはほとんど必要ではないが、この型のナイフメーカーを使用するときはナイフの高さを20
mmにして、それより下を切り離すのに必要である。
|
図16 LKB型のナイフメーカー
|
図17 三慶（株）が製造していたナイフメーカーとナイフ用の板ガラスの写真 |
図18 (図17)のナイフメーカーでガラスナイフを作るときの板ガラスの割断図
（注）水色の部分が鏡面状の割面となる。
円で囲んだ部分は刃先の拡大図：右1/3ぐらいがメスマークのない部分であり、良く切れる。
|
|
semi-thin sectionによる観察
ガラスナイフに切片を浮かせるための水ボートを付けず、乾燥のまま1ミクロン程度の切片を切る（図19）。切片は多少カールしながらナイフエッジに付着するので、これらを先の尖ったピンセットでつまみ、スライドガラス上の水滴の上に落とす。スライドガラスを80℃のホットプレートの上に載せ水分を蒸発させて、切片をガラス上に固着させる。カールしている切片もこの過程で伸展することが多いが、仮に折れ曲がっていても試料の状態を確認するだけであるから問題はない。
図19 試料確認用のsemi-thin section標本の作り方
|
|
図20 染色後のsemi-thin sectionの洗浄図
（注）スクイズボトルからの流水で洗浄する。廃液は空き瓶などで一次的に受け、後に廃棄する。
|
つづいて0.5%トルイジンブルー溶液を載せ、20秒間熱し、流水で染色剤を洗い流し（図20）、再び乾燥してから光学顕微鏡で観察する。切片を作ろうとしている部分の組織中でのおおよそのオリエンテーションがわかるはずである。
トルイジンブルー染色液の作り方
蒸留水100 mLに朋砂(Borax; Sodium tetra-borate) 0.5 gを混ぜて溶解し、その後トルイジンブルー0.5 gを完全に溶解し、使用液とする。
|
さらにトリミングが必要と判断されたときは試料ブロックをミクロトームからはずし、再びカミソリで余計な部分を削除する。これ以上トリミングの必要がないときはナイフをガラスからダイヤモンドナイフに変えて超薄切片製作に移る。光学顕微鏡用の正確なプレパラートを作製する場合はガラスナイフにボートを付け（なお、ビニールテープによる水ボートの作り方は（図21）に概説するが、ダイヤモンドヒストナイフの使用を推奨する。）、切片を水に浮かせたのちガラス棒または白金ループを使い、スライドガラス上の水滴に移動させる（図22）。
図21 ガラスナイフ用水ボートの作り方の図
|
(注）
ガラスナイフ用水ボートの作り方
ビニール製接着テープ（電気工事用絶縁テープなど）4 cmほどの長さで切り、その中央部分にAのようにガラスの幅に合わせた切れ込みを入れる。これをBのようにガラスナイフの先端に被せ、緑色の波線に合わせ、カミソリとハサミで切除する。最終的にCの図のようになる。最後にうす茶色で塗った部分をマニキュアなどで塗り水漏れを防ぐ。なれるとそれほど難しくないが、きれいな光顕用切片を得るためにもダイヤモンドヒストナイフの使用を薦める。なお既製のガラスナイフ用水ボートも市販されている（コラムの図29を参照）。
|
図22 光学顕微鏡用の正確なプレパラートを作製する場合の切片回収法の図
|
|
超薄切片の作製
トリミング、荒削りが終了し、目的の組織細胞が露出されていることが確認できたら、超薄切片作製に移る。（図23）のようにガラスナイフをダイヤモンドナイフに変え、ボートに純水を満たし、再度試料ブロックと慎重に面あわせをおこない、薄切を開始する。薄切速度は通常1
mm/secである。最初の2〜3枚は200〜300 nmの厚切りで、試料全面が薄切できるようになってから、70 nmの超薄切片を切る。切片の厚さは反射干渉色でわかる。銀色の切片は70
nm、金色の切片は9 0 nm, グレーは50 nmである。水位が適当であるとこの干渉色が明瞭になるだけでなく、切片も刃先にとどまらず、水の表面を次々と手前に滑りリボンを形成する（図23）。ダイヤモンドナイフのボートに水を満たすときは5
mL程度の針付き注射器を用いる。はじめ表面張力で盛り上がるほど蒸留水を注ぎ、刃先まで水がなじむようにする。約30秒後、こんどは注射器で水を吸い込み、水面が僅かにへこむようにする。この時水面は反射して透明度が下がり少し白色がかる。また、水が刃先まで達していることを確認する。ダイヤモンドはもともと疎水性が強いので、ちょっとした汚れでも水をはじいてしまうことがあるので注意する。どうしても水のりが悪いときはミクロトームからはずし、70%エタノールで洗浄したのち使用する。
|
図23 超薄切片をダイヤモンドナイフにて作製しているところの写真
（注）薄切した切片は水の上に浮き、反射干渉して銀色に見える。
|
|
グリッド処理と切片採取
水面に浮いている超薄切片はeyelash toolと呼ばれる道具で寄せ集め、4〜5枚の集合を作る。（eyelash toolは直径2 mm長さ10
cm程度の棒の先端に睫毛を一本付けただけの簡単な道具であり自作する。）（図24）のようにこの切片集団にグリッド（メッシュ）を上から被せるようにして切片を吸着させる。エポキシ系の切片の場合は何も処理していないグリッドでも拾うことが出来るが、我々は切片以外の用途にも使用できるように常にフォルムバールの支持膜を張ったグリッドを用意している。フォルムバール膜をグリッドに張るには1%フォルムバール／クロロフォルム溶液を作製し、これを（図25）のような市販の膜作製装置にいれ、均一な厚さの膜をスライドガラス上につくり、これを（図26）のように水面上に展開して作製する。
図24 超薄切片のグリッドへの載せ方を示す図
（注）ボートに浮いている切片はeyelash tool により4〜5枚の集団に分け、それぞれの集団をグリッドで被せるように採取する。
|
|
|
図25 フォルムバール膜張り装置の図
|
（注）
クロロフォルム溶液にフォルムバールを1%になるようにとかし、下のガラス容器に入れる。右側から連球で圧力をかけ、スライドガラスの入っている上のガラス容器の半分ぐらいまで液面を上昇させた後、圧力を解き、一定速度で液面を落下させる。このようにするとスライドガラス表面に一定な厚さの膜が形成される。この膜の一端をカミソリで切り、（図26）のように水面上に展開し、フォルムバール膜を得る。
|
図26 フォルムバール膜の張り方の図
（注）
1 （図25）の膜張り装置でスライドガラス表面上に形成した膜の一端をカミソリで切り、水面上に展開する。
2 グリッドを膜上に並べる。
3 紙を上から被せる。
4 20秒ほどしてから紙を引き上げると膜の張られたグリッドを回収できる。乾燥後使用可能となる。
|
|
染色
オスミウム酸により後固定された試料は電子線に対しある程度コントラストを持つが不十分である。通常、酢酸ウランとクエン酸鉛で二重染色をしたのちに観察する。染色はパラフィルムの上で（図27）のように行う。5分間ウラン染色をおこない（図28）のように最初50%エタノールで洗浄後、さらに蒸留水で洗浄し、鉛染色液に移す。鉛染色の時間は1分である。染色後は再び（図28）のように蒸留水を満たしたビーカーに次々とdippingして洗浄する。洗浄後は乾燥させ電子顕微鏡で観察する。超薄切片法の応用例として、カエル縫工筋の超薄切片の透過電子顕微鏡写真を（図30）として掲げる。
図27 電子染色の図
(注）
上が酢酸ウランによる染色。切片が付いている側を液面に着ける。
下はクエン酸鉛による染色、水洗した後染色液に浸けるので溶液に沈ませた状態にする。
|
|
図28 電子染色したグリッドの洗浄法
（注）
A 酢酸ウラン染色後の洗浄、最初50 mLのビーカーに満たされた50%エタノールに2〜3回dippingした後、3個の100
mLビーカーに満たされた蒸留水にそれぞれで2〜3回、次々とdippingし、洗浄する。
B クエン酸鉛染色後の洗浄、最初から蒸留水で洗浄する。要領は上述の洗浄法と同じ。
|
|
電子染色液の作り方
・ウラン染色液（エポキシ系切片用、疎水性樹脂用）
50%エタノールに5%濃度になるように酢酸ウランを溶解する。この濃度は飽和状態に近いので完全に溶かすには時間がかかる。八割ほど溶ければ染色液としては十分である。紫外線により変性するので遮光して冷蔵庫で保存する。
・クエン酸鉛染色液
50 mLの超純水（ミリQ水）または蒸留水を煮沸し、液中のCO2を除去した水にNaOH顆粒0.2gを完全に溶解し、1号の濾紙で濾過する。濾液は完全に透明でなければならない。つづいて、クエン酸鉛0.2
gを完全に溶解する。ふたたび1号の濾紙で濾過し、使用液とする（濾液は透明）。最終的な濃度は0.4%クエン酸鉛／0.4%水酸化ナトリウム液である。空気中のCO2に触れると白濁しコンタミの原因となるので空気を遮断し冷蔵庫に保存する。我々は10
mLの針付き注射器に保存している。
コラム ガラスナイフとダイヤモンドナイフ
そのむかし、ダイヤモンドナイフは高級品のイメージが強く、多くの形態学者は超薄切片もガラスナイフで切っていた。しかし、研究のスピードが高まるにつれ、ナイフマークもでず、切れ味が良く、繰り返し何回でも使用できるダイヤモンドナイフは必需品となっていった。今や超薄切片を切るのにダイヤモンドナイフを使用しない人は皆無であろう。semi-thin
sectionまでもダイヤモンドナイフを使用する時代となった。（図29）は様々なナイフの写真である。上はトリミング、または光学顕微鏡用(semi-thin
section)で下が電子顕微鏡用(ultra-thin section)。
|
図29 様々なウルトラミクロトーム用ナイフの写真
（注）
1 ガラスナイフ
2 ガラスナイフに既製の水ボートを付けたところ
3 ダイヤモンドヒストナイフ
4 刃幅の狭いダイヤモンドナイフ
5 刃幅の広いダイヤモンドナイフ
6 凍結切片用ダイヤモンドナイフ
このほかサファイヤナイフやトリミング用の鋼のナイフなど目的に合わせ様々なナイフが販売されている。
研究費が潤沢な人は一通りそろえておくと便利である。
|
|
当サイトに掲載している文章・画像などの無断転載を禁じます。
ページトップへ
