２．免疫細胞化学

図4 切片の免疫標識過程を示す図　
（注）パラフィルムを適当な長さ（約60cm）に切り、上下を接着テープで実験台の上に貼り付ける。ここでは画面の都合上、上下二段の別々のパラフィルムに分けているが、実際は一本のパラフィルム上で作業を行う。また接着テープには記録のためこれから標識を行う蛋白質名を書いておくとよい。また、パラフィルムを覆っている薄い紙は一度にすべて剥がすのではなく、実験の進行にあわせて、水滴を載せるスペースだけを剥がすようにする。従って、実験が終了したときにすべての紙が剥がれることになる。グリッドの切片が載っている側をそれぞれの溶液に接するようにして、標識、洗浄の作業をする。希釈後の抗体の量は切片二枚あたり50、また洗浄用のPBS、あるいは蒸留水の水滴は500である。

図5 マウス視細胞外節をオプシン抗体で標識し、金コロイド二次抗体で可視化した電子顕微鏡写真
（注）オプシンが円板膜（Disc membrane）に存在することがよくわかる。

コラム　グリッドメッシュ

メッシュは透過電子顕微鏡で観察する試料を載せる小さな円形の金網であるが、現在材質や網目の形について様々なものが市販されている。100メッシュ、200メッシュと言う名称の100とか200とかいうのは空いている穴の数で、番号が大きいほど小さな穴がたくさんあいていることになる。電子顕微鏡の黎明期にあっては穴の形は円形が多かったが、現在では正方形が一般的である。観察中の試料の移動方向が理解しやすいこと、また同じ穴数のメッシュであれば正方形の方が開口率が高いことなどが普及の原因である。最近ではさらに開口率をあげるため網の線を細くしたthin barと呼ばれるメッシュも売られている。また、ピンセットで掴みやすいようにタブ付きのものもある。材質に関しては銅がもっとも普通であるが、ニッケル、金、モリブデンなどでもつくられている。免疫細胞化学では水溶液に浮かせて標識や洗浄を行うため長時間水溶液に接することになる。このため銅メッシュだとその一部が腐食し、コンタミとなることがある。特に溶液中に沈んでしまったときなどにその傾向が高い。このため、我々はフォルムバール支持膜を張ったニッケルメッシュを使用している。もちろん金メッシュであれば磁化することも腐食することもないのでさらに好都合であるが、柔らかいことと高価であることが難点である。

コラム　免疫細胞化学（免疫標識）にオスミウム酸やエポキシ系樹脂は本当に使用できないか？

この答えは「使用できる」である。ただし、抗原と抗体の性質に依存している。すでに本文中で述べているようにモノクローナル抗体の一部ではグルタールを固定液に用いるだけでも抗原を認識できなくなってしまう。裏を返せば抗原の多数のサイトを認識できるポリクロナール抗体では強い固定液で一部の抗原の認識サイトが潰れてもまだ標識できる能力があるということである。さらに固定液に対し強い抵抗力のある抗原（たとえば膜の内在性蛋白質）であればオスミウム酸で固定し、エポキシ系樹脂に包埋しても免疫標識が可能である。実際、我々はオスミウム酸固定した形態観察用のカエル視細胞のエポキシ樹脂切片を用いてオプシンの免疫標識をおこなった。アルデヒド固定し親水性樹脂に包埋した試料と比べると標識密度は半減するが、背景の微細構造は優れている。一度試してみる価値はある。しかし、優れたポリクローナル抗体と固定に強い抗原蛋白質との組み合わせがあってのことであり、オーソドックスな方法ではないことを理解して実験してほしい。