３．急速凍結法

図8　簡便な浸漬凍結の図

(注）小さな金属製容器を発泡スチロールまたは魔法瓶等の容器に入れ液体窒素を周りに満たし、金属製容器を冷却する。次にエタンガスを小さなノズルを通してこの金属製容器内に噴出させ、液化して貯める。

コラム　凍結速度

　熱の伝導は固体、液体、気体の順で遅くなる。凍結速度のみを上げ純水を無氷晶（vitreous ice）凍結するためにはおよそ10⁵K/secの冷却速度が必要である。この速度を達成できるのは極低温に冷却された金属への接着のみである。しかも接触面から数ミクロンまでであろう。熱の移動は金属の熱伝導率と接着面に依存している。そのため、圧着凍結では金属は純銅を用い、その表面は鏡面仕上げとするが、それでも凍結は均一にはならない。加圧凍結に期待が寄せられたのはこのためである。見た目には金属より液体の方が試料周辺に回り込み接触するので冷却速度が上がるように思えるが、多くの液体冷媒は比熱が小さく、接触と同時に気化し、試料に付着するので著しく冷却速度が低下する。

コラム　従来の凍結

　凍結速度を上げずに無氷晶凍結する方法として加圧凍結が考案されたが、これを化学的に行う方法がグリセリンなどの凍結防止剤の添加である。しかし、グリセリンは細胞そのものを破壊してしまうのでグルタールアルデヒドで化学固定してからでないと使用できない。したがって、急速凍結法が確立されるまではフリーズフラクチャーレプリカ法は全て固定した試料を使って行われた。40〜50%のグリセリン濃度では液体窒素に漬けるだけで無氷晶凍結が可能であるが、画像がシャープではなくなるので、グリセリン濃度を25〜30%ぐらいまで低下させ少しだけ凍結速度を上げることが考えられた。そのため融点と沸点が離れており、できるだけ低い温度で固化する気体を用いた。20年ほど前ではFreon 22が一般的であったが、生産が中止されてからはプロパンが使用された。今でもプロパンを使用している人も多いが細胞内にしみこむ性質があることなどで現在ではエタンが一般的になっている。プロパンは空気より重いため局所にたまりやすく引火爆発しやすいのが欠点である。一方、エタンは引火性がさらに強いもののプロパンより軽いので局所に貯留することは少ない。いずれにせよFreonとは違うので通気性の良いところで凍結する必要がある。エタンなどの冷媒を一度冷却凝固させてから、金属棒などを中心部に押し当て、冷媒の一部を融解し、スラッシュ状にしてそこに試料を浸漬して凍結する。