６．細胞膜剥離法（unroofing）

（１）超音波による細胞膜剥離
（２）接着による細胞膜剥離

（２）接着による細胞膜剥離

準備するもの：

アルシアンブルー塗布カバーガラスの作り方

1. シャーレに濾紙を敷き、その上に2.5 mm×2.5 mmのカバーガラスを必要な分だけ置く（普通15〜20枚）。
2. カバーガラスをプラズマコーターでイオンクリーニングし親水化する。親水化はAlcian Blue水溶液を載せやすくするために行うので、必須ではない。
3. 1% Alcian Blue水溶液カバーガラスの上に載せ、約１分間処理する。
   （なお、接着性を高めるには高分子量（70,000以上）のPoly-L-lysineなども使用できるが、Alcian Blueの形状が小さいので使用している。）
4. 蒸留水でAlcian Blueを洗い流し、乾燥させてから使用する。ガラス表面がほんの僅か青みがかる程度が良い。接着性は時間と共に劣化するので2日間以内に使用する。

膜剥離のプロトコール

1. シャーレで細胞を培養する。（底面の8〜9割を占めるぐらいまで増殖させる。）
2. 培養液を除き、37℃まで暖めたHEPES ベースの哺乳類リンゲル液(+Ca)で一回洗浄する。
3. リンゲル液を捨て、あらかじめアルシアンブルー溶液で接着性を高めたカバーガラスを細胞の上に載せる。
4. 10〜20秒後、固定をしないのであれば、ピンセットでカバーガラスの端を掴み引き上げるかKHMgE 緩衝液を端から注ぎカバーガラスを浮かせることで、背側の膜を採取することが出来る（図3を参照）。直ぐに急速凍結できない場合、あるいは免疫標識を行う場合は0.1〜0.5% glutaraldehyde 、2% paraformaldehydeを含むKHMgE 緩衝液を端から注ぐ。カバーガラスはapical側の膜を接着したまま浮き上がる。固定液は接着効果を強くするので収量がよくなる。

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