構造細胞生物学によく用いられる溶液

1　緩衝液やリンゲル液を作るためのstock solution
2　HEPES based Mammalian Ringer's solution (+Ca) : 培養細胞の洗浄
3　HEPES based Mammalian Ringer's solution (-Ca)
4　NaHCa buffer (outside buffer)
5　KHMgE buffer (inside buffer)
6　Alucian Blue 溶液
7　Poly-L-lysine 液
8　Quenching solution
9　Blocking solution

1 緩衝液やリンゲル液を作るためのstock solution

1M CaCl₂

100 mLビーカーに11.1 gのCaCl₂を入れ、純水約80 mLを加えスターラーで撹拌する。完全に溶解したら溶液を100 mLメスシリンダーに移し、純水を加え全体で100 mLとする。

1M MgCl₂

100 mLビーカーに20.3 gのMgCl₂・6H₂Oをとり、純水約70 mLを加えスターラーで撹拌する。完全に溶解したら溶液を100 mLメスシリンダーに移し、純水を加え全体で100 mLとする。

0.1M EGTA

200 mLビーカーに9.4 gのEGTA ( Ethylene glycol-bis (-amino ethylether) -N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrasodium)をとり、純水約180mLを加えスターラーで撹拌する。完全に溶解したら溶液を200 mLメスシリンダーに移し、純水を加え全体で200 mLとする。

2N NaOH

100 mLビーカーに8.0 gのNaOHをとり、純水約70 mLを加えスターラーで撹拌する。完全に溶解したら溶液を100 mLメスシリンダーに移し、純水を加え全体で100 mLとする。

1N NaOH

100 mLビーカーに4.0gのNaOHをとり、純水約70 mLを加えスターラーで撹拌する。完全に溶解したら溶液を100 mLメスシリンダーに移し、純水を加え全体で100 mLとする。

2N KOH

100 mLビーカーに11.2 gのKOHをとり、純水約70 mLを加えスターラーで撹拌する。完全に溶解したら溶液を100 mLメスシリンダーに移し、純水を加え全体で100 mLとする。

2 HEPES based Mammalian Ringer's solution (+Ca) : 培養細胞の洗浄

組成

155 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 3 mM NaH₂PO₄, 10 mM Glucose, 5 mM HEPES (pH 7.4)

作り方 (1L)

・NaCl　9.06 g
・KCl　0.22 g
・NaH₂PO₄ 　0.36 g
・HEPES 　1.20 g
・Glucose 　1.80 g

1. これらを１ Lのビーカーに入れ、純水800 mLを注ぎよく撹拌する。
2. 完全に溶けたら、1M MgCl₂溶液を1 mL加える。
3. 1M CaCl₂ 水溶液を2 mL入れる。
4. 撹拌しながら1N NaOHをパスツールピペットで少しずつ数mL注ぎpHを7.2〜7.4に合わせる。
   （一度に入れないこと、撹拌しながら少しずつ滴下する）
5. 溶液を1 Lのメスシリンダーに移し、純水を加え全体量を1 Lとする。

この溶液は培養細胞の洗浄のほか1% BSAを加えることにより長時間のliving cell イメージングに使用できる。また、BSAの代わりに10% fetal calf serumを使用すればより生理的条件で観察できる。（pH指示薬のneutral redは入れない）

3　HEPES based Mammalian Ringer's solution (-Ca)

Poly-lysine溶液の作製や実験上生理的条件下でかつCaを除去したいときに用いる。

組成

155 mM NaCl, 3 mM KCl, 3 mM EGTA, 5 mM MgCl₂, 3 mM NaH₂PO₄,10 mM glucose, 5 mM HEPES (pH 7.4)

作り方 (1L)

・NaCl　9.06 g
・KCl　0.22 g
・NaH₂PO₄　0.36 g
・HEPES　1.20 g
・Glucose　1.80 g

1. これらを1 Lのビーカーに入れ、純水800 mLを注ぎよく撹拌する。
2. 完全に溶けたら、1M MgCl₂溶液を5 mL加える。
3. さらに撹拌しながら0.1M EGTAを30 mL徐々に入れる。
4. 濁りがないことを確認後、2N NaOHをパスツールピペットで少しずつ、数mL注ぎpHを7.2〜7.4に合わせる。
5. 溶液を1 Lのメスシリンダーに移し、純水を加え全体量を1 Lとする。

4　NaHCa buffer (outside buffer)

細胞の固定、免疫細胞化学などに用いる。

*1倍濃度の場合

組成

30 mM HEPES, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂ ( pH7.4)

作り方 (1L)

・HEPES　7.15 g
・NaCl　5.82 g

1. これらを１ Lのビーカーに入れ、純水800 mLを注ぎよく撹拌する。
2. 完全に溶けたら、1M CaCl₂溶液を2 mL加える。
3. 2N NaOHをパスツールピペットで少しずつ、数mL注ぎpHを7.4に合わせる。
   （一度に入れないこと、撹拌しながら、少しずつ滴下する）
4. 溶液を1 Lのメスシリンダーに移し、純水を加え全体量を1Lとする。

*2倍濃度の場合

組成

60 mM HEPES, 200 mM NaCl, 4 mM CaCl₂ ( pH7.4)

作り方 (1L)

・HEPES　14.3 g
・NaCl　11.7 g

1. これらを１ Lのビーカーに入れ、純水800 mLを注ぎよく撹拌する。
2. 完全に溶けたら、1M CaCl₂を4 mL加える。
3. 2N NaOHをパスツールピペットで少しずつ、数mL注ぎpHを7.4に合わせる。
   （一度に入れないこと、撹拌しながら、少しずつ滴下する）
4. 溶液を1 Lのメスシリンダーに移し、純水を加え全体量を1 Lとする。

5　KHMgE buffer (inside buffer)

UnroofingやPermeabilizedした細胞の内部構造の保存。

*1倍濃度の場合

組成

30 mM HEPES, 70 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 3 mM EGTA (pH 7.4)

作り方 (1L)

・HEPES　7.15 g
・KCl　5.22 g

1. これらを１ Lのビーカーに入れ、純水800 mLを注ぎよく撹拌する。
2. 完全に溶けたら、1M MgCl₂溶液を5 mL加える。
3. さらに撹拌しながら0.1M EGTAを30 mL徐々に入れる。
4. 濁りがないことを確認後、2N KOHをパスツールピペットで少しずつ、数mL注ぎpHを7.2〜7.4に合わせる。
5. 溶液を1 Lのメスシリンダーに移し、純水を加え全体量を1 Lとする。

*2倍濃度の場合

組成

60 mM HEPES, 140 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 6 mM EGTA (pH 7.4)

作り方 (1L)

・HEPES　14.3 g
・KCl　10.4 g

1. これらを1 Lのビーカーに入れ、純水800 mLを注ぎよく撹拌する。
2. 完全に溶けたら、1M MgCl₂溶液を10 mL加える。
3. さらに撹拌しながら0.1M EGTAを60 mL徐々に入れる。
4. 濁りがないことを確認後、2N KOHをパスツールピペットで少しずつ、数mL注ぎpHを7.2〜7.4に合わせる。
5. 溶液を1 Lのメスシリンダーに移し、純水を加え全体量を1 Lとする。

6　Alucian Blue 溶液

細胞膜の接着採取に使用。

組成

1% Alucian blue in DW (weight %)

作り方 (25 mL)

アルシアンブルー0.25 g を栓付き瓶にとり、24.75 mLの純水を入れ、撹拌し、溶解する。

7　Poly-L-lysine 液

unroofingに先立ち、細胞をカバーガラスに固着させるために使用。

組成

Poly-L-lysine (middle chain, 70 KD) 0.5 mg/mL in Ca free Mammalian Ringer's solution

作り方

購入したPoly-L-lysineは濃度が10 mg/mLになるように一度にCa free Mammalian Ringer's solution に溶解し、エッペンチューブに1 mLずつに分けて、-20℃で保存する。使用時にこれを室温に戻し、Ca free Mammalian Ringer's solution にて20倍に希釈し、ミリポアフィルター(MILLEX-HV: ポア径0.45 mm)で濾過して使用液とする。

8　Quenching solution

フリーのグルタールアルデヒド基を塞ぐため。

組成

50 mM Lysine, 50 mM Glycine, 50 mM NH₄Cl in KHMgE buffer

作り方 (250 mL)

・Lysine　2.23 g
・Glycine　0.94 g
・NH₄Cl　0.67 g

1. これらを500 mLビーカーに入れる。
2. 一倍濃度のKHMgE bufferを200 mL入れ、完全に溶解する。
3. その後500 mLのメスシリンダーに溶液を移し、さらにKHMgE bufferを足して全体量を250 mLとする。

9　Blocking solution

免疫フリーズエッチングレプリカにおいて一次抗体の非特異的結合を軽減する。

組成

1% BSA in KHMgE buffer

作り方 (200 mL)

1. BSA (Fraction V) を冷蔵から取り出し、室温にもどす。
2. 2 g計量し、200 mLビーカーにとる。
3. KHMgE bufferを150 mL加え、スターラーで撹拌する。
4. 完全に溶解したら、メスシリンダーに移し、KHMgE bufferを足し、全体で200 mLとする。

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